×تعيين جنسيت جوجه ها پيش از تفريخ بصورت اتوماتيك
ترجمه از :مهندس وحيد حقي
روياي تعيين جنسيت جوجه ها پيش از تفريخ كم كم تبدل به واقعيت مي شود.در مقاله ذيل اصول و روش هاي كاربردي ويژه اي شرح داده شده است.
صنعت جوجه كشي جهان هر ساله ميلياردها جوجه يكروزه توليد مي كندكه هر جو جه پس از تفريخ تعيين جنسيت مي شود. جوجه هاي نر از همان ابتدا به تدبير انسان جدا شده و جوجه هاي ماده براي توليد تخم مرغ پرورش داده مي شوند. معدوم ساختن جوجه هاي نر باعث سلب حقوق حيوانات و صرف كردن مباحث گوناگون حول محور ذكر شده در صنعت مرغداري مي شود. با استفاده از فن آوري رو به رشد جاري مي توان جوجه ها را پيش از تفريخ بصورت اتوماتيك تعيين جنسيت نمود و جنين هاي درون تخم ها را به جاي قرباني كردن جوجه هاي يكروزه ، به شيوه أي معقول و مقبولِ عام معدوم ساخت. علاوه بر آن تعيين جنسيت جوجه ها بصورت خودكار باعث كاهش استرس ناشي از تعيين جنسيت دستي مي شود كه نهايتا منتج به كاهش دورة انتظار جوجه ها شده و دسترسي سريع تر به آب و دان را ميسر مي سازد. اصول اوليه روش مذبور عبارت از تعيين استروژن در مايع آلانتوئيكِ موجود در تخمِ جنين هاي ماده است. ابزارهاي اوليه ويژه اي براي نيل بدين مقصود ابداع شده اند كه به شرح ذيل ميباشند:
• ابزار اوليه جهت جمع آوري نمونه هاي مايع آلانتوئيك از تخم ها در آخرين مراحل رشد جنين
• ابزار اوليه جهت تعيين ميزان استروژن در نمونه هاي مايع آلانتوئيك
• ابزار اوليه جهتِ دسته بندي و انجامِ واكسيناسيون تخمي و در آخر انتقالِ تخم هاي تعيين جنسيت شده ابداع و تكميل اين نوع دستگاه ها در مقياس تجاري در مرحله آزمايش است.
اصول تعيين جنسيت به روش دستي
اصول اوليه تعيين جنسيت به روش ژاپني يا ركتال در سال 1920 ميلادي پايه گذاري شد. با اين روش ژاپني ها در يافتند طي يكي دو روزِ ابتداي زندگي جوجه مي توان از روي برجستگي ها ، خطوط و چين هاي ركتوم پي به جنسيت جوجه برد (Jull, 19 34; Masui &Hasimoto ,1933 ). تعيين جنسيت به روش ركتال تغريبا نوعي هنر است كه اغلب توسط آسيايي ها انجام مي شود و مهارت و تمركز ويژه أي همچون تمركز زِن (Zen) را مي طلبد ( Hoh,1997 ). به علت سرعت عمل بالاي سِكسرها اغلب حدود 4/1% تا 8/1% وازدگي (اشتباه)و 5/0% تا 0/1% ميزان مرگ و مير بالا مي رود. آن ها معمولا كارگرهاي قراردادي هستند و مدام از يك جوجه كشي به جوجه كشي ديگر مي روند. آن ها در جوجه كشي اغلب ساعات كسل كننده أي را مي گذرانند. آمد و شدِ اين افراد بين جوجه كشي ها همواره صنعت مرغداري را در معرض انتقال بيماري ها بين مراكز توليد طيور قرار مي دهد.
روش ديگر تعيين جنسيت استفاده از سرعت رشد پرها در جوجه هاي هم خون است كه عامل اصلي آن ژن K است (Warren,1976 ) . در اين روش با آزمايش طول نسبي پوشش اوليه و پرپوشِ بال در جوجه هاي يكروزه اي كه حامل ژن K هستند جنسيت جوجه تعيين مي گردد. در اين روش همواره فرض بر آن است كه جوجه هاي مذكر ژن رشد كند پر و جوجه هاي ماده ژن رشد سريع پر را حمل مي كنند. اين روش نسبت به روش ژاپني ارزان تر بوده ونياز به نيروي كارٍ ماهر نيز ندارد. اما ژنٍ K كه سرعت رشد پرها را تعيين مي كند با نوعي ويروسٍ اندوژن ( ويروسي از خانوادهء اونكورنا ـ مترجم ) (Bacon et al., 1988 ) ارتباط دارد. اين ويروس باعث نوعي مقاومت ايمو نولوژيك (مصونيت) در برابر بيماري لوكوز لمفوئيد (Crittenden et al., 1987) مي شود و لذا در پرورش انبوه نوعي نقص محسوب مي شود. برخي از نژادهاي طيور نيز داراي رنگ هاي ويژه اي در پرهاي خود هستند كه در هر جنس متفاوت مي باشد اما اين نژادها نيز به اندازه نژادهاي ديگر داراي ارزش تجاري نيستند. لازم به ذكر است ميزان خطاي تعيين جنسيت بر اساس رنگ بيشتر از خطاي روش تعيين جنسيت از روي سرعت رشد پر است.
اصول تعيين جنسيت به روش خودكار
استقبال از روش تعيين جنسيت جنين طيور بصورت خودكار منوط به كاركرد دستگاهي است كه دقتِ تمايز آن براي هر 20000 تا 30000 تخم در ساعت حدود 5/98% باشد. البته هزينه تمام شده نيز نبايد بيش از هزينه تعيين جنسيت به صورت دستي باشد. تحقيقات پيشين عوامل فيزيولوژيك ديگري را اصول كار خود قرار داده بودند مانند : سرعت ضربان قلب (Laughlin et al .,1976 ;Glahn et al 1987 )، تمايز PCR از روي كرومزوم W ويژه در جنس ماده( Clinton ;1994;Uryu et al 1989;Petitte,1992 ) ، رزونانس هسته اي مغناطيسي براي تعيين تمايزات آناتوميك مثل اختلاف در غدد دو جنسِ نر و ماده(Vandenabeele, et al ,1993) ،و در نهايت سير و روندِ سلول شناختيِ تخم به عنوان اصول اصلي و بالقوه تعيين جنسيت تخمِ طيور . اما اصول طرح شده در اين مقاله شامل تعيين تركيبات مختص جنس در مايع جنيني تخمِ مرغ است( Gill et al ,.1983 ).
اساس تعيين جنسيت دستگاهِ خودكار وجودِ تركيبات استروژني در مايع آلانتوئيك جنينهاي ماده و عدم وجود اين تركيبات در مايع جنيني جنين هاي نر ميباشد. پيشتر ميزان استراديول در مايع آلانتوئيك جنين هاي گوشتي 17 روزه به وسيله كيت تجاري آن موسوم به كيت RIA (Diognostic Products,Los Angeles ,california ) اندازه گيري شده است.سطح استراديول در مايع آلانتوئيك جنين هاي نر قابل يافت و اندازه گيري نيست و يا اگر يافت شود كمتر از Pg/mg 42 است. اما سطح استراديول يافت شده در مايع الانتوئيك جنين هاي ماده چيزي حدود 830-113 Pg/mg مي باشد كه دست كم سه بار بيشتر از مقدار يافت شده در جنين هاي نر است.طي تحقيقات به عمل آمده بر روي 490 نمونه مايع آلانتوئيك معلوم شد استروژن تركيب شيميايي بي نظيري است كه به سادگي مي توان به وسيله آن جنسيت جنين طيور را آشكار ساخت. استروژن موجود در مايع آلانتوئيك اغلب به صورت تركيبات “سولفات” يا” گلوكورونيد” يافت مي گردد. براي يافتن استروژن آزاد در مايع آلانتوئيك اين مايع ابتدا بايد با سولفاتاز يا گلوكورونيداز فراوري شود (تا استروژن از تركيبات ديگر جدا شود) . جنين مرغ را مي توان بر اساس وجود تركيبات استروژني در مايع آلانتوئيك جنين ماده در خلالِ روزهاي 13 تا 18 زندگي جنين تعيين جنسيت كرد . لازم به ذكر است توجه به سن گله يا نژاد جوجه ها ضرورتي ندارد.
بررسي تحليلي تركيبات استروژني موجود در مايع آلانتوئيك دستگاه خودكار تعيين جنسيت مجهز به يك سنسور زنده ( LifeSensors Inc.Malven PA ) جهت تشخيص تركيبات استروژن در مايع آلانتوئيك است. اين سنسور زنده به لحاظ ژنتيك يك مخمر اصلاح شده است كه توليد و ترشح گيرنده استروژن انساني براي آن تعريف شده است ، ژن حامل كه داراي عامل عنصر پاسخگوي به استروژن است با آنزيم.coli E- B galactosidase جفت گرديده است( Butt & Chen ,1999 ). اين سلول مخمر همچنين قادر به توليد و ترشح آنزيم E.coli glucuronidase است ، اين آنزيم داراي قابليت شكستن تركيبات “گلوكورونيد – استروژن” است. استروژن به كمك آنزيم ياد شده از تركيب گلوكورونيد – استروژنِ موجود در مايع جنيني جداسازي مي شود. گلوكورونيدازمي تواند داراي منشاء ترشح از سنسور مخمر باشد و يا آنكه به محيط رشد مخمر افزوده شده باشد. گيرنده استروژن در حضور استروژن با عناصر پاسخگو به استروژن تشكيل باند يا پيوند مي دهد و نسخه برداري از ژن حامل را آغاز مي كند. بدين ترتيب ميزان غلظت استروژن در مايع آلانتوئيك با مقدار تحريك ژن حامل پيوستگي پيدا مي كند. فعاليت محصول ژن حامل يعني B_galactocidas با استفاده از سوبسترايي موسوم به O_Nitrophenil_beta-D_Galactopyranosidas (ONPG ) اندازه گيري مي شود . تركيب نهايي ماده أي زردرنگ است كه براي كالري متري يا اندازه گيري از روي رنگ مورد استفاده قرار مي گيرد. سنسور زنده قادر است مقادير پيكومولارِ هورمونِ تانيث يعني استروژن را تشخيص دهد. سويهء اصلي اين سنسور زنده يعني مخمر ( Saccaromyces Cervasia )كاربرد فراواني در صنعت پخت نان دارد.
سنسور حيرت انگيز ما قادر است تنها با استفاده از 4ul از مادهء آلانتوئيك , نر يا ماده بودن جنين را تشخيص دهد اما دستگاه خودكار تعيين جنسيت براي اطمينان از نتايج حاصله از 20ul مايع جنيني استفاده مي كند. نتيجهء كار سنسور در آزمايشگاه 100% موفقيت آميز بوده است.
نمونه برداري از مايع آلانتوئيك
مايع آلانتوئيك محيطِ ترشحي متابوليت هاي نيتروژني جنين مرغ محسوب مي شود (Romanoff, 1967 ). مايع آلانتوئيك از حوالي روز پنجم زندگي جنين پديدار مي شود وتا سيزدهمين روز به حداكثر مقدارِ خود مي رسد. با كم شدن رطوبت محيط و باز جذب آن حجم اين مايع نيز كاهش مي يابد اما تا روز هجدهم هنوز حجم قابل تمايزي ( mls 1تا 2 )از آن قابل تشخيص مي باشد( Romanoff, 1967 ).
تنها موانع بينِ مايع آلانتوئيك و پوستهء تخم مرغ غشاء هاي داخلي و خارجي پوسته و غشا هاي كوريو آلانتوئيك هستند. هر چند كه مايع آلانتوئيك تمام محيطِ تخم مرغ واجدِ جنين را احاطه كرده است اما تجمع آن بيشتر در راس تخم مرغ درست زيرِ غشاءهايي است كه روي اتاقك هوايي قرار دارند. علت تجمع مايع آلانتوئيك در راس تخم مرغ بيشتر به خاطر نيروي جاذبه و جايگزيني جنين و كيسهء زرده در زير است. به خاطر متغيير بودن حجم كيسهء هوايي بين تخم مرغ ها نمونه برداري از مايع آلانتوئيك در وضعيتِ ايستادهء تخم مرغ اغلب با مشكلاتي همراه است.
مي توان از نيروي جاذبه براي راندنِ مايع آلانتوئيك به محل مناسب نمونه گيري استفاده كرد. اگر تخم مرغ را در محور طولي آن بخوابانيم ، مايع آلانتوئيك در راس درست زيرِ پوسته قرار مي گيرد. بدين ترتيب با خواباندن تخم مرغ به پهلو كار نمونه برداري به ميزان 20ul بسيار ساده خواهد شد و آزمونِ سنسور ما ميسر مي گردد. كمپاني Embrox يك نمونهء ابتدايي با يك خط توليد ابداع كرده است كه مايع آلانتوئيك را از تخمِ جوجه هاي گوشتي نمونه برداري مي كند. با بهينه كردنِ فرايندِ نمونه برداري هنگام استقرار تخم مرغ در محور طولي در جزئياتي چون عمق نمونه برداري ، نوع سوزن مورد استفاده ، ميزان مكش ، و زاويهء استقرارِ تخم مرغ حدود 96% از تخم مرغ ها آزمايش خود را با موفقيت گذراندند. در نمونه هاي بعدي تجاري بايد عملكرد دستگاه بهتر باشد. نمونة ابتدايي دستگاه خودكار تعيين جنسيت كمپاني Embrex يك نمونهء تجاري ابتدايي با قابليت 5000 هزار تخم مرغ در ساعت ابداع كرده است كه هم اكنون در حال سپري كردن آزمايش خود در يك سالنِ جوجه كشي است و سازندگان پيوسته براي بهينه شدن عملكردِ دستگاه در تلاشند. دستگاهِ خودكارِ تعيين جنسيت شامل سه اتاقكِ مستقل از هم است كه به وسيلهء يك شبكه باهم ارتباط دارند. اتاقك ِاول ، محفظه اي است كه از مايع آلانتوئيك نمونه برداري مي كند. دسته أي از تخم مرغ ها طي روزهاي 15 ، 16 يا هفدهمين روز از 21 روز دوره رشد جنين به صورت دستي ،طيِ چرخه اي جمع آوري مي شوند و بر روي نقاله اي قرار مي گيرند. سپس يك سنسورِ نوري به صورت اتوماتيك تخم مرغ هاي تميز را تشخيص داده و سپس تخم مرغ هاي كثيف به وسيلهء لوله هاي مكنده أي جدا شده ودر شانه هايي جداگانه قرار مي گيرند. در مرحلهء بعد شانه هاي مذكور دوباره تخم مرغ ها را به جايگاهشان باز گردانده و متمركز مي سازند. حال نوبت سوزن نمونه برداري است كه درست در مركز، در عمق ويژه أي وارد هر تخم مرغ شده و 20ul مايع آلانتوئيك را نمونه برداري مي كند .حال نمونه هاي مايعِ جمع آوري شده در شيارهاي ِيك قالب پلاستيكي با باركد ترموفرم ( باركدِ ساخته شده به وسيلهء حرارت ) ريخته شده و ته نشين مي گردند. هر قالب تقريبا داراي 2500 شيار است كه به همان ترتيب همانندِ تخم مرغ ها قرارگرفته اند. سوزن ها در پيِ هر نمونه برداري از هر تخم مرغ تميز مي شوند. در مرحله بعدي تخم مرغ ها در شانه هايِ واجدِ باركد به صورت ايستاده دوباره قرار گرفته و مجدداً به محل سالن جوجه كشي بازگردانده مي شوند. سپس قالب هاي آزمايش به صورت دستي در چرخ دستيِ قفسه داري قرار مي گيرند . حال نوبت كامپيوتر شبكه است كه باركدِ شانه هاي تخم مرغ را با قالب هاي حاوي مايعِ آلانتوئيك تطابق دهد. اتاقكِ دوم يك نمونهء آزمايشگرِ خودكار است. به كمكِ يك اپراتور چرخدستي ِحاويِ قفسه هاي قالب ها واردِ دستگاهِ خودكارِ آزمايشگر مي شود. قالبها به كمك يك سيستمِ انتقال دهنده زيرِ سُرنگ توزيع قرار مي گيرند. در اين بخش سرنگ توزيع به هر شيار 30ul مٌعرفِ ويژهء سنسورِ زنده اضافه مي كند. افزودنِ معرف به شيارهاي يك قالب 5 تا 6 دقيقه زمان نياز دارد. سپس هر قالب به طور جداگانه به مدت 4 ساعت در يك محفظهء انكوباتور تحت شرايط تعريف شده قرار مي گيرد. در مرحلهء بعد سوبستراي ONPG به طور اتوماتيك به هر شيار افزوده مي گردد ، پس از 30 دقيقه رنگ هاي مٌعرف آشكار مي گردند. با ظهورِ رنگ ها يك دوربين CCD به دقت از هر شيار اسكن مي گيرد و نر يا ماده بودنِ هر تخم مرغ تعيين مي گردد. از اينجا به بعد كار ساده است ، اطلاعات جمع آوري شده با شانه هاي تخم مرغ ها تطبيق داده مي شود . سپس تمام قالب هاي حاوي معرف آزمايش به صورت اتوماتيك جمع آوري شده و بر روي چرخدستي قرار مي گيرند. در نهايت اين قالب ها پيش از انهدام ضدعفوني مي گردند تا سنسور زندهء موجود در آن ها به طور كامل از ميان برود.
اتاقك سوم وظيفة دسته بندي تخم مرغ هارا بر اساس جنسيت بر عهده دارد. همچنين در اين بخش تخم مرغ هاي نر معدوم گشته و تخم مرغ هاي ماده نيز در رديف هايي چيده- شده و پس از واكسيناسيونِ درون تخمي روانهء سبدهاي تفريخ مي گردند. در حقيقت اين شبكهء كامل بر اساس باركد موجود بر روي شانه ها و اطلاعات طبقه بندي شده جنسيت تخم مرغ ها را تعيين مي كند.
تاثيرات اين روش بر تفريخ
آزمايشات بسياري براي ارزيابي تاثيرات تعيين جنسيت به روش ياد شده در حال انجام است. در اين روش ناگزيريم طي روزهاي 15 ،16 يا هفدهمِ رشد جنين ابتدا يك سوراخ در پهلوي تخم مرغ و سپس در روزهاي 18 يا نوزدهم سوراخ ديگري در راس تخم مرغ براي انجام واكسيناسيون ايجاد كنيم. تا كنون آزمايشات بسياري براي تعيين تاثيرات اين روش بر تفريخ تخم صورت گرفته است.
در تحقيقات اوليه تاثير ايزوله يا قرنطينه بودنِ محل نمونه برداري بر ميزان تفريخ ارزيابي شده است. طي اين آزمايش تخمِ ، مرغ هاي گوشتي در روز شانزدهمِ انكوباسيون به صورت دستي سوراخ شدند سپس به دستگاه هاي ستر بازگردانده شده و مجددا در روز نوزدهمِ انكوباسيون به صورت درون تخمي واكسينه شدند. پس از انجام دو آزمايش مشخص شد ايجاد سوراخ در پوستهء تخم مرغ در روز شانزدهم موجب كاهش تفريخ به ميزان 2 % مي شود(جدول 1 ). حتي به كار بردن تدابير ويژهء قرنطينه نيز كاهشِ تفريخ را تعديل نكرد.
جدول 1-تاثير تدابير قرنطينه بر ميزان تفريخ در تعيين جنسيت به صورت خودكار
|
تيمار |
آزمون اول %زنده تفريخ شده |
آزمون دوم %زنده تفريخ شده |
ميانگين |
جمع كل |
|
شاهد |
A 8/95 |
0/96 |
9 /95 |
(36)5145 |
|
سوراخ شده |
B7/93 |
3/94 |
0 /94 |
(36)5145 |
|
سوراخ و قرنطينه |
B1/94 |
8/93 |
0/94 |
(36)5145 |
حروف A و B اختلاف معني داري معادل ( p<.05 ) است.
در آزمايشات بعدي تاثير ضدعفوني كردن جايگاه برميزان تفريخ پيش از سوراخ كردن و نمونه برداري از تخم مرغ ها ارزيابي شد . آزمايشات از تاثير مثبت ضدعفوني پيش از نمونه برداري خبر دادند .در اين روش آثار منفي سوراخ كردنِ پوسته در روزِ شانزدهمِ انكوباسيون تا حدودي جبران مي شد (جدول 2).در سال 2002 ميلادي تعيين جنسيت به وسيلهء دستگاه هاي ابداعي اوليه و تاثير آن ها بر ميزان تفريخ ارزيابي گرديد.
جدول2- تاثير ضدعفوني جايگاه برميزان تفريخ پيش از نمونه برداري
|
تيمار |
%زنده تفريخ شده |
جمع كل تخم مرغ ها |
|
شاهد |
A 96/6 |
(42)5670 |
|
سوراخ شده |
B 95/7 |
(42)5670 |
|
ضدعفوني و سوراخ كردن |
A 96/7 |
(42)5670 |
نتيجه
كمپاني Embrx در نهايت امكانپذير بودنِ اصول اين روش را در سالن هاي جوجه كشي آينده روشن خواهد ساخت. مشكلاتِ جدي اين روش شاملِ مواردِ ذيل است:
امكان نمونه برداري با درصد بالا از هر تخم مرغي بدون توجه به شكل واندازهء آن البته بايد تاثيرات منفي اين روش بر ميزان تفريخ و بر عملكرد آتي جوجه در فارم هاي تجاري اندك باشد.فراهم آوردن نيروي كارِ ماشيني كافي و قابل اطمينان به وسيلهء دستگاه ه هاي ابداعي ودر نهايت عملكرد دقيق و صحيحِ سنسور زنده در محيطِ جوجه كشي ها با از ميان رفتن موانع ياد شده كمپاني Embrex در آينده دستگاه هايي با قابليت فراوري 20000 تا 30000 تخم مرغ در ساعت خواهد ساخت. در صورت موفقيت آميز بودن اين روش تا حدودي از بحث هاي مربوط به حقوق حيوانات در خصوص معدوم كردن جوجه هاي نر كاسته خواهد شد و جنجال كمتري خواهيم داشت.
